2 实验方法
2.1 单味药之制备 将单味药经粉碎后,加十倍重量之50%酒精, 60℃水浴回流抽取2h,趁热过滤。 同法两次后合并滤液经减压浓缩制约1/10体积量。经冷冻干燥得粉末状浓缩物,其产率见表1所示,将冷冻粉末置于20℃冰柜中以备下列实验使用。
2.2 一般溶液之配制
2.2.1 PBS (phosphate buffer solution )之配制 将KCl 0.2g， NaCl 3.0g ， NaH2PO4・7H2O2.16及KH2PO4 0.2g溶于次蒸馏500ml中,高压减菌后使用。
2.2.2 MTT配制方法 称取MTT 5mg溶于10ml成浓度500μm,制完全溶解后以0.22μm之过滤膜过滤。
2.3 检测药物之制备 实验前将冷冻干燥之各种药品精称10mg,以1ml DMSO溶解,再用研钵细磨后,以0.22μm microfilter unit过滤,分别调制成浓度为10mg/ml之 stock solution。每次检测时,加入2μl stock solution于每孔含198μl培养液中,使最后单位药之浓度100μg/ml。
2.4 试验细胞之制备
2.4.1 子宫肌瘤和正常子宫组织 从荣民医院手术室取出后,置于含DMEM的试管中,以冰块冷冻带回实验室,于1h内切碎进行组织培养。
2.4.2 子宫肌瘤和正常子宫组织 将其分别切成1mm之小块,加入1.5mg/ml collagenase type Ⅱ和0.25% trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠状,用胶吸管打散细胞(pipetting ),经离心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再离心后去上清液。加入5ml DMEM均匀分布于培养皿, 2天换一次培养液,于5%CO2 37℃培养7～14天。待细胞生长形成单层细胞(monolayer )细胞数约1×106cells/ml既可使用。
2.5 试验细胞之染色 将初代培养的子宫肌瘤细胞和正常细胞,培养于培养皿中,利用免疫组织化学方法,经染色、照相后,作为试验细胞鉴别区分之用。组织培养之新鲜标本于培养基中,以PBS溶液清洗, 再以0.03%过氧化氢溶液浸泡30min,经PBS溶液清洗10min,接着进行免疫化学染色,所使用的单株抗体为抗人类黄体素接受抗体 (monoclonal anti-human progesterone receptors antibody )。以适当浓度之单株抗体与培养细胞作用约1h,经 PBS溶液洗10min后,以经生物素标示之二次抗体 (biotinylated secondary antibodies )作用30min,在经 PBS溶液清洗10min后,以经具有过氧化酶之卵蛋白作用30min,经 PBS溶液清洗10min后,以呈色剂 (DAB,3,3-diaminobenzidine )呈色5min,以 PBS溶液清洗,以苏木精做对比染色,之后置于镜下观察照相［7～9］
2.6 Bcl-2蛋白之制备 利用0.25% trypsin将细胞处理成悬浮液后,将细胞稀释成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培养盘中,使每孔约含2×106个细胞,放入5%CO2培养箱中37℃培养。次日,细胞生长形成单层细胞(monolayer )后,倒掉培养液,更换新鲜培养液后备用。同时各孔加入 estradiol或progesterone(stock solution 浓度各为 10μg/ml、100μg/ml ) (13)1μl后24h,再加入中药 (stock solution浓度为 10mg/ml )10μl使浓度成为100μg/ml。 24h后冲下细胞,离心 (12000r）20min去上清液后加RIPA 30μl备用。第一组Estradiol (10ng/ml )；第二组Estradiol (10ng/ml ) + 王不留行(100μg/ml )；第三组Estradiol (10ng/ml ) + DMSO 10μl；第四组Progesterone (100ng/ml ) + DMSO 10μl；第五组Progesterone (100ng/ml ) + 王不留行(100μg/ml )；第六组对照组。
2.7 Western blot 分析法［10，11］ 利用 Bioquant Protein (200μl )将细胞萃取物定量,按比例取出加入protein dye 3μl 。将 Total protein loading至10% SDS-PSGE后,以80V电泳 3h,利用电转印槽 (Electrotransfer tank )以270mA 1h,将蛋白质面 SDS-PAGE转至 PVGE membrane后,加入 Blocking solution (1%Bovine serum BSA )1h,分别加入 Bcl-2 rabbit polyclonal IgG,α-tubulin mouse monoclonal IgM (1∶1000 )4℃置1夜,再以 PBST清洗,分别加入 anti-rabbit IgG和 anti-mouse IgG (1∶5000 )1h后,再以 PBST清洗后加呈色剂至呈色为止,再以清水洗去呈色剂后晒干。本篇论文共 6页,当前在第 3页 1 2 3 4 5 6 |